色谱常见问题（1）-HPLC液相常见问题回答（下篇）
19.除了流速外，还有哪些因素能引起压力改变？
改变流动相组成和温度；改变柱长、柱内径和填料粒度；柱突然阻塞压力升高（正常情况下其它条件不变柱压都是逐渐升高的）。
20.什么是强溶剂、弱溶剂？
改变流动相的组成或溶剂溶剂强度就可以改变峰容量因子和保留时间。在一定条件下，减少保留时间或缩短分析时间的溶剂为强溶剂，增加保留时间或延长分析时间的溶剂为弱溶剂。
21.怎样才会使峰位发生重排？
在分析多组分样品时，仅改变流动相的强度（组成百分比）而不改变其组成，一般仅仅改变所有组分的保留时间，不会发生峰位的重排。下列条件改变可能发生峰位重排：流动相中换了强溶剂；PH值的改变；柱填料的改变；柱温的改变；流动相的组成改变（如加入离子对试剂三乙基胺等）。
22.除了在线脱气，常用的实验室脱气方式还有哪些？
加热回流脱气，脱气效果最佳，但无法保持；氦脱气，此方法脱气效果佳，能除去百分之九十以上的空气，但氦气价格太贵，所以用的不多；真空脱气，效果仅次于氦脱气，但脱气过程中容易造成样品溶液挥发损失；超声脱气，只能脱去约百分之三十的空气，但在实验室中最常用。目前还是尽量争取用在线脱气，方便且效果好。
23.评价一个色谱柱的最基本指标有那些？
评介一根色谱柱的基本指标是：塔板数、峰不对称因子、柱压降、适用范围和键合相浓度以及峰容量。
24.什么是色谱的时间常数？
时间常数实际上是响应时间的设定，起着过滤噪音的作用。时间常数太小（太快）可能增加短噪音，时间常数太大（太慢）可能出宽峰、拖尾峰。
25.为什么在实验过程中有时会出现倒峰？
所用的流动相在检测波长下有吸收，而进在此波长下没有吸收或吸收低于流动相的溶液，在流动相中会出现洞穴，通过柱后出现倒峰。
26.为何会出现“胖"峰和平头峰？怎样避免？
用比流动相强度大的大体积样品进样，通常会损害色谱图的质量，而出现“胖"峰和平头峰。应遵循下列规则选用溶剂溶解样品：A最好用流动相溶解样品进样。B用大体积弱溶剂溶解样品，如反相色谱中用水溶解样品进样，主要缺点是每次进样后在色谱图的开头出现大的负峰，有时还波及到样品峰。C需要时用强溶剂溶解进样。
27.什么是次级保留效应？
在良好的色谱分离中，样品分子是以单一的保留过程被保留。如在反相色谱中，溶质与柱填料的非极性烷基链发生疏水性相互作用。但在以硅胶为基质的填料中，有些样品组分能与硅醇基团相互作用，脱附的过程很慢，使峰严重拖尾，这就是次保留过程。对付次保留效应最有效的方法就是选用封尾更好色谱柱或加入流动相改良剂（也叫扫尾剂）。
28.前延峰的发生及处理？
因柱温问题很易引起前延峰，有些样品在常温下分离可见前延峰，提高温度后前延峰的现象消失。在离子对色谱中，前延峰的另一个原因是用非流动相作样品溶剂。因此在离子对色谱中要求仅用流动相溶解样品，而且进样量不要太大，否则会导致前延峰或其它问题。在RP-HPLC中样品溶液的强度大于流动相引起前延峰。增加流动相的强度，减少样品溶液的强度，在离子对色谱中增加离子强度，可以克服前延峰的效应。此外使用流动相溶解样品是解决的最简单实用的方法。
29.峰变宽的原因？
A在使用过程中柱本身退化，逐渐降低柱效。B柱外峰宽效应。一根很好的专用柱用于另一液相色谱系统引起塔板数降低，说明新系统有很大的柱外峰宽效应。C化学效应，多数是流动相和固定相相互作用所致，改变流动相可使宽峰有所改善。
30.柱平衡慢的常见原因有哪些？
柱平衡慢的常见原因是，组分在旧的或新的流动相中对柱吸附强，或者在新的流动相中浓度小甚至为零。A流动相含有胺改良剂；B流动相含有离子对试剂；硅胶柱；流动相中有四氢呋喃。可考虑采用专用柱用于特殊的方法，不用时将柱折下来，注满适当的溶剂或流动相，密封保管，不再作其它的分析。
31.用内标法实验时对内标物的要求有哪些？
A内标物的结构或理化性质应与被分析组分相似或相近；B内标物的保留值应稍大于或小于被分析物的保留，不能相差过大；C内标物的峰要与所有被分析物的峰有良好的分离度（R大于1.5），不能让内标物成了干扰物；D无结构相似的内标物，可用保留相近的内标物；E仪器对分析物的响应与内标基本一致，出峰面积大小不能相差悬殊。
32.管子切割与安装注意事项？
A管子的断面必须垂直，否则，将会产生死体积而引起色谱峰峰形扩展。B确保管子内表面不被损伤，如果损伤，可能会发生管路堵塞。C将管子完全插入开口端，直至其与开口端的末端相碰为止。否则，将会产生死体积而引起色谱峰峰形扩展。D不要过分拧紧螺帽，以防损坏螺纹。
33. 什么是HPLC的“无限直径效应"？
在HPLC分析中由于使用了高效微粒固定相及高压流动相，样品以柱塞式注入色谱柱后，因柱的阻力大，样品分子在柱中的分子扩散很小，直至它从色谱柱流出也未与色谱柱内壁接触，因而引起的色谱峰形扩展很小，能保持高柱效。
34.如何评价一台检测器？
A噪声：通常噪声是指由仪器的电气元件、温度波动、电压的线性脉冲以及其他非溶质作用产生的高频噪声和基线的无规则波动；
B基线飘移：漂移是基线的一种向上或向下的缓慢移动，可在较长时间（0.5~1h）内观察到。它可掩蔽噪声和小峰。漂移与整个液相色谱系统有关，而不仅是由检测器引起的；
C灵敏度（最小检出浓度或最小检出量）：在一个特定分离工作中， 检测器是否有足够的灵敏度是十分重要的。当比较检测器时，常使用敏感度这一性能指标。敏感度即指信号与噪声的比值（信噪比）等于2时，在单位时间内进入检测器的溶质的浓度或质量；
D线性范围：在进行定量分析时，希望检测器有宽的线性范围，以便在一次分析中可同时对主要组分和痕量组分同时进行检测；
E检测器的池体积：它应小于最早流出的死时间色谱峰的洗脱体积的1/10，否则会产生严重的柱外谱带扩展。
35.如何简单判断比例阀是否内漏？
设定泵使用一个单独通路（A），打开Purge阀，流速5ml/min，提起其他溶剂瓶内的溶剂过滤头直至离开液面，观察这些通路（B、C、D）内的溶剂是否随着流动，正常时均不应流动。
36、色谱峰面积与已知浓度溶液的成分不成比例
可能原因：36.1保留时间出现错位，影响因素：室内温度25左右，温度波动大；流动相比例必须严格精密配置，醋酸增加会影响流动相的PH值；
37、流动相中不同成分对峰形、分离度的影响
对于反向色谱法，一般为非极性固定相c18和C8， 流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢富喃等与水互溶的有机溶剂用于调整保留时间，为控制样品在流动相中的解离，常用缓冲液（冰醋酸）控制流动相的PH值，c18和C8的PH值多控制在2.5-7.5之间。冰醋酸可调整流动相PH值，另外可减少峰形脱尾。增加分离度可适量减少甲醇。
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